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微生物菌落總數檢測方法和注意事項
作者:totaltest 發表時間:2016-12-05
菌落總數主要是作為判定食品被細菌污染程度的標記,也可以應用這一方法觀察食一中細菌的性質以及細菌在食品中繁殖的動態,以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供科學依據。
 
菌落總數測定的幾項說明
 
1.菌落總數的測定:
是以檢樣中的細菌細胞和營養瓊脂混合后,每個細菌細胞都能形成一個可見的單獨菌落的假定為基礎的。由于檢驗中采用37℃于有氧條件下培養(空氣中含氧約20%),因而并不能測出每g或mL檢樣中實際的總活菌數,厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長,有特殊營養要求的一些細菌也受到了限制,因此所得結果,只包括一群能在普通營養瓊脂中發育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細菌菌落的總數。
 
2.鑒于食品檢樣中的細菌細胞是以單個,成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在,因而在營養瓊脂平板上出現的菌落可以來源于細胞塊,也可以來源于單個細胞,因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數字不應報告活菌數,而應以單位重量、容量或表面積內的菌落數或菌落形成單位數(colony forming units,CFU)報告之。
 
3.每種細菌都有它一定的生理特性,培養時,應用不同的營養條件及其他生理條件(如溫度、培養時間、pH、需氧性質等)去滿足其要求,才能分別將各種細菌都培養出來。因此,要得到較全面的細菌菌落總數,應將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養基上,并培養在不同條件下,如溫度,氧氣供應等。但國家頒發的食品衛生標準對不同食品的菌落總數的規定,都是根據用普通營養瓊脂進行需氧培養所得的結果確定的,因此在食品的一般衛生學評價中并不要用幾種不同的非選擇性培養基培養。
 
菌落總數的測定
 
測定食品中菌落總數時,是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液,然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內與營養瓊脂相混合,經培養后,按一定要求計算出皿內瓊脂平板上所生成的細菌集落數,并再根據檢樣的稀釋倍數,計算出每g或mL樣品中所含細菌菌落的總數。
 
菌落總數測定中的一些要求和規定
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況,檢驗時必須遵循以下一些要求和規定:
(一)所用器皿及稀釋液:
1.檢驗中所用玻璃器皿,如培養皿,吸管、試管等必須是完全滅菌的,并在滅菌前徹底洗滌干凈,不得殘留有抑菌物質。
2.用作樣品稀釋的液體,每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現幾個菌落時,要追加對照平板,以判定是空白稀釋液,用于傾注平皿的培養基,還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3.檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水,但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1%蛋白胨水為合適,因蛋白胨水對細菌細胞有更好的保護作用,不會因為在稀釋過程中而使食品檢樣中原已受損傷的細菌細胞導致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如,醬品等)進行稀釋,則宣采用蒸餾水。
 
(二)檢樣稀釋:
1.檢樣稀釋時,應以無菌手續稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠),經充分振搖作成l:10的稀釋液。如,系肉、魚等固體樣品,最好剪細于滅菌乳缽內與稀釋液研勻,或與稀釋液同置于滅菌均質器杯中(國產均質器,目前以江蘇武進鄭陸醫學儀器廠產品較簡便而實用),以8000~l 0000rpm速度攪拌1分鐘,使做成均勻的1:10稀釋液。
2.根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計,將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當的10倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成l:100的稀釋液,然后依次遞增稀釋,做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次,必須另換1支l mL滅菌吸管,這樣所得檢樣的稀釋倍數方為準確。
3.從吸管筒內取出滅菌吸管時,不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內的吸管的外露部分;而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時,也不要觸及瓶口及試管口的外側部分;因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
4.在作10倍遞增稀釋中,吸管插入檢樣稀釋液內不能低于液砸2.5cm;吸入液體時,應先高于吸管刻度,然后提起吸管尖端離開液面,將尖端貼于玻璃瓶或試管的內壁使吸。管內液體調至所要求的刻度,這樣取樣較準確,而且在吸管從稀釋液內取出時不會有多余的液體粘附于管外。  
5.當用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內時,應小心沿管壁加入,不要觸及管內稀釋液,以防吸管尖端外側部分粘附的檢液也混入其中。
 
(三)平板接種與培養:
1.將稀釋液加至滅菌平皿內時,應根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計,選擇2~3個適宜稀釋度,分別在作10倍遞增稀釋的同時,即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(從皿側加入,不要揭去皿蓋),最后將吸管直立使液體流畢,并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出,而不要吹出。每個稀釋度應作2個平皿。
2.用于傾注平皿的營養瓊脂應預先加熱使融化,并保溫于45±1℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時,每皿內傾入約15mL,最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3.為了防止細菌增殖及產生片狀菌落,在檢液加入平皿后,應在20分鐘內向皿內傾入瓊脂,并立即使其與瓊脂混和均勻。
4.檢樣與瓊脂混和時,可將皿底在平面上先向一個方向旋轉,然后再向相反的方向旋轉,以使充分混勻。旋轉中應加小心,不要使混和物濺到皿邊的上方。為了保證混和均勻,而不濺及皿邊的上方,可使用江蘇省無錫縣衛生防疫站童鶴泉設計制成的自動平皿旋轉儀,直接將加有檢樣的平皿放在旋轉儀上(可同時放4只平皿),加入瓊脂后,開動電鈕,在數十秒鐘內即可自動左右旋轉而使皿內的檢樣與瓊脂混合均勻。
5.皿內瓊脂凝固后,不要長久放置,然后始翻轉培養,而應于瓊脂凝固后,在數分鐘內即應將平皿翻轉予以培養,這樣可避免菌落蔓延生長。必要時,可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內經15~60分鐘使瓊脂表面干燥后,再將皿底移至蓋內倒置于溫箱內培養。這樣可以阻止運動性強的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴展生長。
6.為了控制污染,在取樣進行檢驗的同時,于工作臺上打開一塊瓊脂平板,其暴露的時間,應與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當,然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內培養,以了解檢樣在檢驗操作過程中有l無受到來自空氣的污染。
7.培養溫度:
應根據食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養,水產品用30℃培養。培養時間為48±2小時。其他食品,如,清涼飲料,調味品,糖果、糕點.果脯,酒類(主要為發酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用37℃24±2小時培養。培養溫度和時間之所以有這種不同的區分,乃是因為在制定這些食品衛生標準中關于菌落總數的規定時,分別采用了不同的溫度和培養時間所取得的數據之故。水產品因來自淡水或海水,水底溫度較低,因而制定水產品細菌方面的衛生標準時,系用30℃作為培養的溫度。
 
(四)對照試驗:      
1.加入平皿內的檢樣稀釋液(特別是10:1的稀釋液),有肘帶有食品顆粒,在這種情況下,為了避免與細菌菌落發生混淆,可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿,不經培養,而于4℃環境巾放置,以便在計數撿樣菌落時用作對照。
2.為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆,也可在已溶化而保溫于45℃水浴內的瓊脂中,按每100ml加lmL,0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5triphenyltetrazolium chloride,TTC)水溶液之量加入適量的TTC。培養后,如是食品顆粒,不見變化,如為細菌,則生成紅色菌落,配好的TTC溶液,應先用來與不加TTC的作對照,以觀察其對計數是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗處保存,以防受熱與光照而發生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養基中,如果有細菌存在,培養后,在細菌脫氫酶的作用下,TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan),使菌落呈現紅色。
 
(五)菌落計數:
1.從溫箱內取出平皿進行菌落計數時,應先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內平板上菌落生長情況。平行試驗的2個平板與菌落數應該接近,不同稀釋度的幾個平板上菌落數則應與檢樣稀釋倍數成反比,即檢樣稀釋倍數越大,菌落數越低,稀釋倍數越小,菌落數越高。
2.計數菌落時,應選取菌落數在30~300之間的平板作為菌落總數測定的標準。1個稀釋度使用兩個平板,應采用兩個平板平均數;如其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數,若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。如在一個稀釋度的兩個平板中,一個平板的菌落數在30~300之間,另一個大于300或小于30時,則以菌落數在30~300間的平板作為計數的標準。
3.注意事項
(1)如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高,則系檢驗工作中發生的差錯,屬實驗室事故。此外,也可能因抑菌劑混入樣品中所致,均不可用作檢樣計數報告的依據。
(2)如果平板上出現鏈狀菌落,菌落之間沒有明顯的界限,這是在瓊脂與檢樣混合時,一個細菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計,如有來源不同的幾條鏈,每條鏈作為一個菌落計,不要把鏈上生長的各個菌落分開來數。此外,如皿內瓊脂凝固后未及時進行培養而遭受昆蟲侵入,在昆蟲爬過的地方也會出現鏈狀菌落,也不應分開來數。
(3)如果所有平板上都有菌落密布,不要用多不可計作報告,而應在稀釋度最大的平板上,任意數其中2cm2個,除2求出每cm2內平均菌落數乘以皿底面積63.6cm2數,再乘其稀釋倍數作報告。例如10-1~10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布,而在lO-3稀釋的平板上任數2個cm2。內的菌落數是60個,皿底直徑為9cm,則該檢樣每g(或m1)中“估計”菌落數為:60/2×63.6×1000=1908000或1.9×106。
63.6cm2數系按皿底直徑為9cm時計算而得,即:(9/2)2×3.14=63.6;如所用平皿的皿底直徑不是9cm,則可按其直徑的實際cm數代人圓面積公式求出。
(4)菌落計數中,如能使用國產JLQ-S。型菌落計數器(江蘇武進鄭陸醫學儀器廠產品),則比較方便,燈光由側面射向平板,菌落易于觀察。由于儀器帶有電子音響訊號,用特制金屬探筆點數中,在發出音響之下始顯示數字增加,不會發生差錯。且燈光與平板之間夾有多用方格玻質規板(方格面積為lcm2),也有助于對菌落密布的平板進行計數。
(5)檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料),則平板計數中應相應地將有關微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除,不可并入檢樣的菌落總數內作報告。一般在校正檢樣的pH7.6后,再進行稀釋和培養,此類嗜酸性微生物往往即不易生長。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時,要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養所生成的菌落涂片染色作對照,以資辨別。酵母菌卵圓形,遠比細菌大,大小為2~5×5~30μm,革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在24小時內,于普通營養瓊脂平板上在有氧條件下培養,通常是不生長的。
 
(六)報告方式
1.當檢樣的菌落數為l~100時,按實有數報告;大于100時,只記錄左面頭兩位數字(用兩位有效數字作報告,可避免產生虛假的精確概念),左面第三位數字則用四舍五入法計算,從第二位數字之后都記為0,為了縮短數字后面的0數,也可用10的指數來表示,例如菌落數為37750時,即可寫成3.8×l05。
2.檢樣的菌落數如系從菌落密布的平板上按比例計算而求得,報告結果時,應在菌落數前加上“估計”二字。
3.檢樣為固體,用重量法取樣檢驗時,以g為單位報告其菌落數;檢樣為液體,用容量法取樣檢驗時,以mL為單位報告其菌落數;如檢樣為樣品表面的涂擦液,則應以cm2為單位報告其菌落數。
4.如檢樣為液體,在兩個平皿內所加lmL未經稀釋的檢樣(原液)培養中,均無細菌集落生成,則報告為lmL檢樣內未有菌落生長,或1mL檢樣內菌落數<1。
 
特殊的方法
 
(一)平板表面涂布法
將營養瓊脂制成平板,經50℃,l-2小時或35℃,18-20小時干燥后,于其上滴加檢樣稀釋液0.2mL,用L捧涂布于整個平板的表面,放置片刻(約10分鐘),將平板翻轉,移至36±1℃溫箱內培養24±2小時(水產品用30℃培養48±2小時),取出,按前述方式進行菌落計數,然后乘以5(由0.2mL換算為1mL),再乘以樣品稀釋的倍數,即得每g或mL檢樣所含菌落數。
此法較上述傾注法為優,因菌落生長在表面,便于識別和檢查其形態,雖檢樣中帶有食品顆粒也不會發生混淆,同時還可使細菌不必遭受融化瓊脂的熱力,不致因此而使菌細胞受到損傷而不生長,從而可避免由于檢驗操作中的不良因素而使檢樣中細菌菌落數降低。但是本法取樣量較傾注法為少(僅傾注法的五分之一),代表性將受到一定的影響。
 
(二)平板表面點滴法
與涂布法相似,所不同者,只是用標定好的微量吸管或注射器針頭按滴(使每滴相當于0.025mi)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區域(預先在平板背面用標記筆劃成四個區域),每個區域滴1滴,每個稀釋度滴兩個區域,作為平行試驗。滴加后,將平板放平片刻(約5~10分鐘),然后翻轉平板,如前移入溫箱內培養6~8小時后進行計數,將所得菌落數乘以40(由0.025mL換算為1mL),再乘以樣品稀釋的倍數,即得每g或mL檢樣所含菌落數。
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